Výhodou alternativních metod in vitro je provedení testu za kontrolovaných podmínek, vysoký stupeň standardizace metody, omezení variability mezi experimenty, nepřítomnost vedlejších systémových účinků na organismus, vysoká rychlost a možnost současně testovat řadu látek a jejich kombinací, malé množství materiálu potřebného k provedení zkoušky, minimální produkce toxického odpadu a především možnost použít v testu buňky lidského původu nebo transgenní buňky nesoucí lidské geny. Použití trojrozměrných modelů rekonstruovaných lidských tkání jako je kůže či rohovka umožňuje lépe klasifikovat kožní a oční dráždivost u lidí než použití živých zvířat, která vykazují odlišné reakce vzhledem k rozdílům ve fyziologii, anatomii a metabolismu. 

Testy in vitro zatím neumožňují zkoušet systémové účinky látek ani interakci mezi jednotlivými tkáněmi a orgány, farmakokinetiku a chronickou toxicitu. Obecně platí, že v buněčných nebo tkáňových kulturách lze studovat pouze dílčí aspekty účinků léků nebo chorobného procesu.  Některé progresivní metody in vitro byly schopny nahradit pokusy na zvířatech v určitých oblastech nebo v určitých fázích vývoje léčiv, ale například test zkoumající vliv látky na rakovinné buňky v buněčných kulturách neumožňuje získat informace o působení této látky v organismu, kde dochází k její absorpci, distribuci v jednotlivých orgánech, metabolismu a exkreci.  Přestože existují již pokusy simulovat celý organismus kombinací tkáňových kultur  a počítačových simulací (např. Organ-On-A-Chip), dosud jsou při vývoji léčiv většinou nutné studie na zvířatech.